PI活细胞/死细胞双染试剂盒*啦

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Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM细胞毒性极低，是适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发，仅可观察到死细胞。

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就200µl细胞悬液进行染色，分别可以做500次和1000次检测。

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产品组分

运输和保存方法

其中A组分和B组分需-20℃避光干燥保存，C组分-20℃保存，经常使用可放在4℃保存。一年有效。

使用方法

1. 工作液的配制

1.1  1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制

从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH₂O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

1.2  1×染色工作液的配制

1）先将低温保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室温20-30min。

【注意】：次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。

2）取5µl Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的适浓度。梯度筛选的原则为使用低的探针浓度得到好的荧光结果。

【注意】：由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

2. 染色步骤

2.1 对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3min）。

对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×10⁵~1×10⁶细胞/ml。

2.4 取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。

【注意】：如果需要，可延长孵育时间至30min。

2.5 荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

【注意】：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的佳工作浓度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的佳工作浓度。

c) 用0.1-10µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

注意事项

1）由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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