信帆生物带您深度了解Real-time qPCR

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Real-time qPCR实验设计

实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个real-time qPCR而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。

1. 实验材料的处理和准备

以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。

一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。

2. 引物设计

一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则：

扩增产物长度在80-150bp。

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

产物不能形成二级结构。

产物长度一般在15-30碱基之间。

G+C含量在40%-60%之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物5’端可以修饰。

引物3’端不可修饰。

引物3’端要避开密码子的第3位。

Taqman@探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则：

尽量靠在上游引物；

长度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；

5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量

Real-time qPCR操作过程

1. RNA提取和反转录

在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：

（1）全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

（2）使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。

（3）在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水漂洗干净后高压灭菌备用。

当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。

2. Mix配制

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

（1）MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

（2）更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。

（3）每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！

（4）所有成分加完后，离心去除气泡。

（5）每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

3. 仪器设置

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：

A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke"，进行“定量"实验。

B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。

E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备

F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。

G. 反应体系的设置：

A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none"。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！

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